Tra le attrici italiane è stata una delle più amate. È riuscita a farsi strada nel cinema italiano, grazie alla sua intelligenza e a un grandissimo senso dell'umorismo. Non era facile, nella stagione d'oro delle maggiorate, imporsi nel mondo dello spettacolo. La concorrenza delle varie Lollobrigida, Loren, Pampanini e Allasio era fortissima e Maria Luisa - bella e dal volto illuminato e sensibile, senza essere procacemente provocante - dovette crearsi, partendo dalla gavetta, il proprio posto al sole. A diciotto anni, vinta la resistenza dei genitori, si iscrive all'Accademia d'arte drammatica, diplomandosi a pieni voti nel 1953: "Dopo il provino mi hanno detto che andavo benissimo, ma temevano che la mia voce non fosse abbastanza solida per far teatro e mi hanno chiesto un certificato medico. Lo specialista che sono andata a trovare non voleva darmelo e ho dovuto minacciare di buttarmi sotto una macchina per ottenerlo. E dire che non ho mai avuto problemi con la voce". Il suo insegnante di Teatro è il grande Sergio Tofano, che si accorge subito della sua esuberante vis comica. A teatro si mette in luce interpretando La Mandragola di Macchiavelli e L'avaro di Molière con Tofano. Sempre con la compagnia di Tofano interpreta Il cane bassotto del signor Bonaventura. Nel 1956 è una briosa interprete teatrale in Sei storie da ricordare e nel 1959 in Capricci di Marianna. Il suo esordio al cinema avviene nel 1956 con il film Ridere, ridere, ridere. Nel 1958 recita al fianco dell'allora più nota Sandra Mondaini nel film di Mario Amendola Le dritte. 

Decisivo per la sua carriera cinematografica è l'incontro con Michelangelo Antonioni. Sta per sposarsi con un fidanzato architetto quando lo incontra. Quella storia d'amore finisce e lei diventa la compagna di vita e la musa ispiratrice del regista ferrarese. "Ha una bella nuca, potrebbe fare del cinema". È Michelangelo Antonioni che parla dalla cabina di regia, mentre lei sta doppiando Dorian Gray, personaggio principale del film Il grido (1957). Il primo film insieme, realizzato nel 1959, è L'avventura, che vale all'attrice il suo primo riconoscimento ufficiale: una nomination come migliore attrice straniera al British Academy Awards nel 1961. Ricorda Monica Vitti che per le riprese di L'avventura: "Giravamo in un'isoletta vicino a Panarea, nelle Lipari. Non c'era niente, né acqua, né soldi, né contatti col mondo esterno. Michelangelo chiamava Roma utilizzando un vecchio radiotelefono dell'esercito americano, tentando di ottenere soldi dalla produzione". Dopo questo film Antonioni dirige la Vitti in La notte (1961), L'eclisse (1962) e Deserto rosso (1964): tutti film tutt'altro che facili, destinati a piacere più ai critici che al pubblico, che fanno di Monica Vitti una star internazionale. L'attrice corre però il rischio di pietrificarsi nel suo personaggio di donna difficile e complessata, piccola borghese destinata a soccombere davanti a problemi della vita vera. Antonioni ne aveva fatto il simbolo vivente della difficoltà di vivere in un mondo che stava cambiando troppo in fretta e che stava perdendo progressivamente il senso delle proporzioni. Ma lei, pur possedendo un forte temperamento drammatico, vuole dimostrare di essere un'attrice poliedrica, capace di spaziare nei vari generi, con una particolare predilezione per la commedia.
Diventa l'attrice "brillante" più popolare del cinema italiano degli anni '60 e '70. Nel 1963 recita nel film Alta infedeltà diretto da Luciano Salce. Nel 1965 interpreta Le bambole di Dino Risi. E ancora: Ti ho sposata per allegria (1967) di Luciano Salce e La ragazza con la pistola (1968) di Mario Monicelli. Con questo film vince nel 1968 il Premio San Sebastian come migliore attrice protagonista. Nel 1969 interpreta Amore mio aiutami: è il primo film di e con Alberto Sordi, che mette alla berlina la falsa emancipazione del matrimonio in Italia. L'anno seguente è la protagonista di Dramma della gelosia. Tutti i particolari in cronaca di Ettore Scola accanto ai due straordinari attori quali Marcello Mastroianni e Giancarlo Giannini. S'impone quindi come la "mattatrice" incontrastata, unica donna capace di competere con i grandi comici della commedia all'italiana. Nel 1973 è la protagonista di Polvere di stelle, esilarante commedia cinematografica diretta e interpretata dal grande Alberto Sordi. I due interpretano Mimmo Adami e Dea Dani, capocomici di una scalcinata e affannata compagnia ambulante di varietà, durante la guerra 1940-45. La coppia Sordi-Vitti diventa così una delle coppie più amate del cinema italiano. Il successo di questo affiatato duo sarà riconfermato nel film Io so che tu sai che io so (1981). Nel 1974 viene chiamata da Luis Bunuel ad interpretare la signora Foucauld in Le Fantôme de la liberté (Il fantasma della libertà). Si lega sentimentalmente a Carlo Di Palma, direttore della fotografia di Deserto rosso. Di Palma la dirige nella sua prima regia Teresa la ladra del 1973. Nel 1976 è una regina di tabarin nel film Mimì Bluette... fiore del mio giardino, ancora diretta da Di Palma. Nel 1980 è la protagonista della pellicola Il mistero di Oberwald, un nuovo ruolo drammatico diretta da Antonioni. In tutto riceve tre Nastri d'argento e cinque David di Donatello. Il teatro rimane un suo grande amore: nel 1986 recita accanto a Rossella Falk in La strana coppia, per la regia di Franca Valeri. Due anni dopo recita in Prima pagina di Hecht e MacArthur, diretta da Giancarlo Sbragia. È autrice di due soggetti cinematografici: Flirt, scritto nel 1983 e Francesca è mia, del 1986. Non contenta di essere diventata l'attrice numero uno delle commedie brillanti all'italiana, nel 1989 dirige anche un film, Scandalo segreto, che interpreta al fianco di Elliott Gould e Catherine Spaak. Vince così il Globo d'oro sia come attrice, sia come regista. Nel 1993 pubblica la sua autobiografia intitolata Sette sottane. Nel 1995 le viene assegnato il Leone d'Oro al Festival del Cinema di Venezia. Nello stesso anno pubblica il suo primo romanzo Il letto è una rosa. Della sua vita privata si sa molto poco. Non è mondana, di rado presenzia le premiazioni. Le interviste che rilascia sono poche e mirate. Dopo ventisette anni di fidanzamento, si sposa il 27 settembre 2000 in Campidoglio con Roberto Russo fotografo e regista di sedici anni più giovane di lei, che l'aveva diretta in Flirt nell'83. Dopo essersi ritirata dalle scene a causa delle sue condizioni di salute, si è spenta a Roma dopo una lunga malattia il 2 febbraio 2022 a 90 anni.